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水产品中孔雀石绿(MG)和隐性孔雀石绿色(质)谱检测技术

供稿人:宋鸿  供稿时间:2006-9-21   关键字:孔雀石绿  隐性孔雀石绿  色谱  质谱  
孔雀石绿(malachite green) 是一种合成的三苯基甲烷类工业染料,自1936 年以来,许多国家就将其广泛用作水产养殖业中的杀虫剂和杀菌剂,用来杀灭体外寄生虫和鱼卵中的霉菌。非洲一些国家还用其控制细菌、绦虫、线虫和吸虫等的感染。此外在纺织工业中还广泛用做丝绸、羊毛、皮革和纸张的染料。因孔雀石绿在鱼体内和环境中残留时间长,并有致突变、致畸和致癌的危险性,故我国、美国、加拿大以及欧盟等许多国家均禁止将其作为人类食用鱼的兽药使用。但由于近来在英国市场出售的鲑鱼体内检出禁用的兽药孔雀石绿,欧洲再次响起食品安全警报。此外,日本因在我国出口的鳗鱼中发现孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留,而禁止了鳗鱼成品出口,造成了巨大的经济损失。所以,如何快速、准确的测定该类药物制剂、特别是其代谢物在鱼体内的残留,在世界范围内迫在眉睫。
 
目前国际上对孔雀石绿和隐性孔雀石绿的检测技术路线主要有两条:一条是以色(质)谱技术为核心的化学检测技术,另一条是以竞争性酶联免疫法(ELISA )为代表的快速生物检测技术。
 
在以色(质)谱技术为核心的化学检测技术方面,国内的相关研究有:
 
江苏出入境检验检疫局食品实验室丁涛等人和热电上海科学仪器公司示范实验室的刘飞2006年利用高效液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)方法快速、准确地同时测定鳗鱼中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留量。鳗鱼样品经乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取,液相色谱分配到二氯甲烷层,MCX阳离子固相萃取小柱净化,浓缩定容。以甲醇和甲酸缓冲溶液为流动相,经C18柱分离后,并用串联质谱在电喷雾(ESI+)- 选择反应监测离子(SRM)的模式下,代隐性孔雀石绿为内标,进行质谱定性和定量。该方法无需采用传统PbO2氧化柱,检测限(LOD)为0.2μg/Kg,定量下限为0.5μg/Kg,完全可以达到出口欧盟和日本残留限量要求[1]
 
沈阳市疾病预防控制中心张玉黔等人2006年建立了液相色谱-串联质谱法快速、灵敏、准确地检测水产品中孔雀石绿(MG)及其代谢产物隐性孔雀石绿(LMG)。样品前处理采用液-液萃取、浓缩、过中性氧化铝小柱,吹干定容,以乙腈+0.05mol/L乙酸胺为流动相,进行梯度洗脱,用Diamonsil C18柱进行分离,同位素代孔雀石绿和代隐性孔雀石绿作为内标,采用液相色谱-电喷雾串联质谱正离子方式,同时测定孔雀石绿及隐性孔雀石绿。该方法孔雀石绿及隐性孔雀石绿的平均回收率分别为97.1%和106%,相对标准偏差分别为4.6%,和3.8%。水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿检测的线性范围为0.5~10μg/kg,定量检测下限为0.5μg/kg[2]
 
深圳市疾病预防控制中心刘桂华等2006年以同位素内标稀释建立了测定鱼体中孔雀石绿及其代谢物的高效液相色谱一串联质谱法。试样中加入代同位素内标,用柠檬酸缓冲液/乙腈提取,液液分配后SCX净化,MRM定量。该方法的线性范围为0.5~10μg/L,线性系数为0.9992,检出限为0.1μg/kg。在1.0、1.5、2.0μg/kg3个浓度水平加标回收率为94%~104%。rsd为4.7%~5.9%。结论:该方法灵敏度高,准确度、精密度好,满足了样品测定的定性、定量要求[3]
 
以色(质)谱技术为核心的化学检测技术国外的相关研究有:
 
美国Doerge, Daniel R. 等人(National Center for Toxicological Research, Jefferson, AR 72079, USA) 1998年采用同位素内标稀释建立了检测鱼体中孔雀石绿(MG)及其代谢物隐性孔雀石绿(LMG)的LC-APCI/MS法,同位素 13C6代 MG 和d5代LMG 为内标进行质谱定量鱼肉中的MG和 LMG[4]
 
芬兰Halme K, Lindfors E等人(National Veterinary and Food Research Institute (EELA), Department of Chemistry, Helsinki, Finland) 2004年分别用LC和LC/MS法检测红鳟鱼鱼肉中孔雀石绿及其主要代谢产物隐性孔雀石绿,检出限(LOD)分别为0.8和0.6μg/Kg。用乙腈-醋酸盐缓冲溶液提取,二氯甲烷分离,氧化铝和丙基璜酸自动固相萃取柱净化。以乙腈-醋酸盐缓冲溶液为流动相,经Chromspher 5B柱进行孔雀石绿和隐性孔雀石绿的分离。隐性孔雀石绿经氧化转化为孔雀石绿。在样品浓度范围2-50μg/Kg时,孔雀石绿和隐性孔雀石绿的平均回收率为65% (范围63.4-65.9%, 相对标准偏差3.9-16.1%) 和74% (范围58.3-82.6%,相对标准偏差3.3-11.4%)。用液相色谱-串联质谱法定量测定,孔雀石绿和隐性孔雀石绿的定量检测限分别为2.5和1μg/Kg[5]
 
美国Allen JL等人(U.S. Fish and Wildlife Service, National Fisheries Research Center, La Crosse, WI 54602-0818) 1994年采用液相色谱(LC)方法同时测定红鳟鱼卵、鱼苗、成熟鱼肉中孔雀石绿和隐性孔雀石绿。均匀混合的样品用 [14C]内标的孔雀石绿氯化物强化, 并用1% (v/v)醋酸-乙腈(或甲醇)提取。提取物经氯仿分离、干燥、流动相再溶解,再用液相色谱进行分析(隐性孔雀石绿经氧化转化为孔雀石绿)。以内标孔雀石绿浓度为0.5 和1.00μg /g强化的红鳟鱼卵,总[14C] 孔雀石绿氯化物残留的回收率分别为 85和98%; 以内标孔雀石绿浓度为0.65μg /g强化的红鳟鱼鱼苗,总[14C] 孔雀石绿氯化物残留的回收率为68%; 以内标孔雀石绿浓度1.00μg /g强化的红鳟鱼鱼肉,总[14C] 孔雀石绿氯化物残留的?厥章饰?66%[6]
 
加拿大van de Riet JM等人(Canadian Food Inspection Agency, Dartmouth Laboratory, PO Box 1060, Dartmouth, B3B 1Y9 Canada.)2005年利用高效液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)方法快速、准确的同时测定水产品(如鲑鱼、鲶鱼、罗非鱼和虾等)中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留量。样品经高氯酸-乙腈溶液提取 ,离心分离,浓缩,C18柱分离等。LMG回收率81%,MG回收率 98% 。MG和LMG的检测限都是 0.1 ng/g[7]
 
美国Doerge DR等人(National Center for Toxicological Research, U.S. Food and Drug Administration, Jefferson, AR 72079, USA)1998年用同位素内标稀释液相色谱-大气压化学离子质谱法(LC/MS)快速、准确的同时测定食用鱼中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留量。食用鱼中LMG浓度总是超过MG浓度[8]
 
智利Valle,-L(Correspondence (Reprint) address, P. Richter, Cent. de Estudios para el Desarrollo de la Qumica (CEPEDEQ), Fac. de Ciencias Quimicasy Farmaceuticas, Univ. de Chile, Olivos 1007, Independencia, PO Box 233, Santiago, Chile)等人2005年利用LC 大气压化学电离法测定孔雀石绿和隐性孔雀石绿在鲑鱼中的残留量。检测限为 0.15 μg /kg 。样品浓度2μg /kg时,孔雀石绿和隐性孔雀石绿的回收率分别为70 % (相对s.d. 3.1%) 和85 % (相对s.d. 1.3%)[9]
 
荷兰Hajee, C. A. J.等人 (University of Utrecht, Faculty of Veterinary Medicine, Department of the Science of Food of Animal Origin, Section Chemistry, P.O. Box 80175, TD Utrecht NL-3508, Neth.) 1995年采用快速HPLC方法结合固相提取(SPE)测定鳗鱼血浆中孔雀石绿 (MG)和 隐性孔雀石绿(LMG)残留量。MG 和LMG用甲醇缓冲液提取,用氨气处理后从SPE柱上洗提。MG 和 LMG的平均回收率分别为82±1% 和83±1%。MG的定量限为 5.0g/L ,LMG的定量限为0.9g/L[10]
 
澳大利亚Swarbrick, A.等人(Australian Government Analytical Laboratories, Pymble NSW 2073, Australia)1997 年用反相 HPLC结合 610 nm的吸收检测定量测定rainbow trout鱼肉中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的残留量,分析样品经容积提取,用C18柱固相净化,将隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿。孔雀石绿检测限6 ng/g,隐性孔雀石绿检测限3 ng/g。在25-200 ng/g浓度范围, 孔雀石绿回收率73-87% ,而隐性孔雀石绿回收率89-98% [11]
 
2005年11 月美国FDA的LIB4363规定了鱼和虾中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的LC-VIS法和LC-MSn法。用醋酸胺缓冲液和乙腈提取,二氯甲烷分离。隐性孔雀石绿被氧化成孔雀石绿。样品经固相萃取净化。萃取物用液相色谱-可见光(LC-VIS)分析总MG 。该法的平均回收率鲶鱼为85.9 % (± 8.5 % RSD),鲑鱼为 87.8 % (± 5.1 % RSD), 罗非鱼为93.9 % (± 8.9 % RSD), basa为 90.8 % (± 11.0 % RSD),虎虾为89.9 % (± 8.4 % RSD)。用LC-质谱 (LC-MSn)法测定 MG是另一种测定鱼类中MG 残留量的方法。用LC-MSn测定的LMG的回收率高达75-116 %,相对标准偏差≤ 21 % 。而且测定结果与用LC-VIS 法高度一致。LC-VIS 法对孔雀石绿的检测限为1.0 ppb, LC-MSn法对孔雀石绿的检测限为0.25 ppb[12]
 
2004年11月美国FDA的LIB4334规定了快速液相色谱法测?儆阒锌兹甘毯鸵钥兹甘痰姆椒āS么姿岚坊撼逡汉鸵译嫣崛。燃淄榉掷搿R钥兹甘瘫谎趸煽兹甘獭Q肪滔噍腿【换]腿∥镏蠱G用液相色谱-可见光(LC-VIS)分析总MG。平均回收率94.6 % ,RSD ± 10.7 %。该方法的定量检测限为1 ppb[13]
 
2004年11月美国FDA的LIB4333规定了测定和确认鲑鱼中隐性孔雀石绿的LC-MS方法。利用无放电大气压化学电离(APCI)结合离子捕捉仪器产生离子光谱, 将LC-MS方法用于定量测定鱼类中萃取后转化为孔雀石绿(MG)的隐性孔雀石绿(LMG)的残留量。用于LC-VIS方法的萃取方法同样适用于LC-MS 分析。LMG回收率87-109 %, 相对标准偏差<10%[14]
 
2005年10月美国FDA对孔雀石绿检测方法4333和4334又作了补充,通过LC-VIS和LC-MS测定鲶鱼、basa、罗非鱼、鲑鱼和虾中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿,确证了一个经改进的提取法,并通过测定鳗鱼中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿,验证了该提取法。为获得这些水产品中残留的高回收率,应对LIB4334(第7页)中的鲑鱼提取法进行修改:
1. 初次提取中所用的氧化铝从原来的6克增加到10克。
2.在液-液提取步骤,相位分离时间应控制在10分钟内(鲑鱼方法中是至少15分钟)[15]
 
参考文献:
1.丁涛等,高效液相色谱-串联质谱联用(Finnig TSQ Quantum)测定鳗鱼中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留量,现代科学仪器 2006, (1) 27-29
 
2.张玉黔等,液相色谱-串联质谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿的方法研究,
中国卫生检验杂志 2006,16(7) 826-827
 
3.刘桂华等,同位素内标稀释高效液相色谱-质谱法测定鱼体中的孔雀石绿及其代谢物,
现代预防医学 2006,33(1) 124-126
 
4.Doerge, Daniel R.等,Analysis of malachite green and metabolites in fish using isotope dilution LC-APCI/MS,Advances in Mass Spectrometry, 14, D043100/1-D043100/12 (English) 1998
5.标题:Determination 5.Halme K,Determination of malachite green residues in rainbow trout muscle with liquid chromatography and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,Food Addit Contam. 2004 Jul;21(7):641-8
 
6.Allen JL等,Determination of malachite green residues in the eggs, fry, and adult muscle tissue of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss),J AOAC Int. 1994 May-Jun;77(3):553-7
 
7.van de Riet JM等, Determination of malachite green and leucomalachite green in a variety of aquacultured products by liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection,J AOAC Int. 2005 May-Jun;88(3):744-9
 
8.Doerge DR等,Analysis of malachite green and metabolites in fish using liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry,
Rapid Commun Mass Spectrom. 1998;12(21):1625-34
 
9.Valle,-L等,Determination of the sum of malachite green and leucomalachite green in salmon muscle by liquid chromatography - atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry,Journal-of-Chromatography-A. 2005; 1067(1-2): Mass Spectrometry: Innovation and Application. Part IV., 101-105
 
10.Hajee, C. A. J.等,Simultaneous determination of malachite green and its metabolite leucomalachite green in eel plasma using post-column oxidation,J. Chromatogr., B:  Biomed. Appl.,1995; 669(2), 219-27 (English)
 
11.Swarbrick, A.等,Post-column electrochemical oxidation of leuco malachite green for the analysis of rainbow trout flesh using HPLC with absorbance detection,Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 1997;20(14), 2269-2280 (English) 
 
12.Wendy C. Andersen等,Quantitative and Confirmatory Analyses of Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Fish and Shrimp,FDA/ORA/DFS Laboratory Information Bulletin  No.4363
 
13.Wendy C. Andersen等,Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detection,FDA/ORA/DFS Laboratory Information Bulletin No. 4334
 
14.Sherri B. Turnipseed等, Determination and Confirmation of Leucomalachite Green in Salmon using No-Discharge Atmospheric Pressure Chemical Ionization LC-MSn,FDA/ORA/DFS Laboratory Information Bulletin LIB# 4333
 
15.Wendy C. Andersen等,Amendment:Application of Laboratory Information Bulletins 4333 and 4334 for the Determination of Leucomalachite Green and Malachite Green Residues in Catfish, Basa, Tilapia, Trout, and Shrimp,http://www.cfsan.fda.gov/~frf/mgamend.html
 
 

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