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ELISA法鉴别口蹄疫野毒与疫苗技术

供稿人:彭建新  供稿时间:2006-10-25   关键字:口蹄疫  ELISA  鉴别  疫苗  
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,世界动物卫生组织(OIE)将该病列为A类家畜传染病之首,大多数亚洲、非洲、南美洲国家一直都通过注射灭活疫苗的办法来控制该病的流行。从2001年英国暴发口蹄疫后,欧盟允许在暴发口蹄疫时进行疫苗的紧急接种。因此,建立准确、快捷的鉴别口蹄疫野毒与疫苗的方法,对该病的控制、食品安全和进出口贸易十分重要。以下就国内外ELISA法鉴别口蹄疫野毒与疫苗的技术介绍如下:
 
中国农业科学院兰州兽医研究所朱彩珠等利用大肠杆菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3ABC多肽作为抗原,建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)。通过对336份正常牛血清、508份注射疫苗牛血清、6O份人工感染牛血清和58份豚鼠免疫血清的检测,确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。336份正常牛血清检测结果,特异性为98.21%;508份接种灭活疫苗1~2次后1~6个月的牛血清检测结果,特异性为98.62%;60份实验性感染牛血清的检测结果显示,I-ELISA检出率为95.00%(按D值>0.400为阳性统计)[1]
 
华中农业大学动物医学院阮力等利用大肠杆菌BL21(DE3)表达3B蛋白,建立了间接酶联免疫吸附试验(I-EIISA)区分口蹄疫病毒感染猪与注苗猪的方法[2]
 
上海市农业科学院畜牧兽医研究所潘洁等以大肠杆菌表达重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB为检测抗原,研制了口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA检测试剂盒,该试剂盒可用于判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。在1746份免疫猪血清中,3AB-ELISA对免疫猪血清的特异性为98.68%;在1077份健康非免疫猪血清中,3AB-ELISA对健康非免疫猪血清的特异性为98.68%;在36份人工感染猪血清中,3AB-ELISA对阳性检出率为100%。3AB-ELISA对2031份免疫牛血清检测,特异性为94.04%;3AB-ELISA对336份健康未免疫未感染牛血清检测,特异性为97.96%[3]
 
台湾屏东科技大学兽医学系以杆状病毒表达重组非结构蛋白3AB为抗原,建立了ELISA鉴别猪口蹄疫病毒感染的方法。大母猪经过10次口蹄疫接种,检测结果仍为阴性。利用上述诊断试剂检测100份未免疫未感染猪血清和106份免疫猪血清,阴性率分别为99.1%和100%;检测120份感染猪血清,阳性率为95.8%[4]
 
意大利IZSLER实验室以大肠杆菌表达的非结构蛋白3ABC-FMDV作为抗原,建立了间接ELISA鉴别口蹄疫病毒感染的方法。以光学密度0.20作为切值,检测了137份感染血清,阳性率为100%;检测了一次接种血清228份,有225份为阴性;多次接种血清159份,全部为阴性,阴性率为99%。检测了4444份天然健康动物血清,442份为阴性,特异性为99.5%[5]
 
阿根庭CICV以原核生物表达的3AB1蛋白为抗原,建立间接ELISA鉴别口蹄疫病毒感染的方法。Cutoff值设定为感染后21天最大吸收值的35%。利用该法检测了118份实验性感染的血清,阳性率为97.5%。对109份未免疫未感染血清,阴性率100%。102份一次免疫血清和30份两次免疫的血清,利用上述试剂检测的结果均为阴性[6]
 
意大利的E.Brocchi等对六种ELISAs试剂鉴别口蹄疫病毒感染的性能进行了比较,通过对3551份血清(包括健康血清,免疫血清,感染血清和免疫/感染血清,2/3为牛血清,其余的为羊和猪血清)检测结果的分析,发现由Cedi-diagnostics、IZS-Brescia生产的试剂的性能与OIE诊断手册中描述的NCPanaftosa-screening index相当。利用上述三种试剂诊断免疫牛感染口蹄疫病毒的特异性超过99%,灵敏度达到90%。国外ELISA法鉴别口蹄疫野毒与疫苗的诊断试剂和技术参数见下表[7]
 
Test-kit 
 
Manufacturer/supplie
Format
Antigen/expression system
Species
Conjugates
Thresholda
 
NCPanaftosa- screening
Panaftosa, PAHO, Rio de
Janeiro, Brazil
Indirect ELISA
(antigen coated)
3ABC/E. coli (MS2
fusion protein)
 
Bovine, ovine,
swine
 
Anti-bovine,anti-ovine, anti-swine
≥10 PPb
 
3ABCtrapping-ELISA
IZSLER, Brescia, Italy
Indirect ELISA
(antigen-capture)
3ABC/E. coli (MS2
fusion protein)
 
Bovine, ovine,
swine
 
Anti-ruminants,
anti-swine
≥10 PP
 
Ceditest® FMDV-NS
Cedi diagnostics B.V.,
Lelystad, The
Netherlands
Blocking ELISA
(antigen-capture)
 
3ABC/Baculovirus
All species
Anti-3B monoclonal
antibody
≥50 PIc
 
SVANOVIRTM FMDV
3ABC-Ab ELISA
 
Svanova, Upsala,
Sweeden
Indirect ELISA
(antigen coated)
 
3ABC/E. coli
Bovine
Anti-bovine
≥48 PP
 
CHEKIT-FMD-
3ABC
Bommeli Diagn/Idexx,
Bern, Switzerland
Indirect ELISA
(antigen coated)
 
3ABC/E. coli (GST
fusion protein)
 
Bovine, ovine,
swine
 
Anti-ruminants,
anti-swine
≥20 PP
 
UBI® FMDV NS ELISA
United Biomedical Inc.,
New York, USA
Indirect ELISA
(antigen coated)
 
3B synthetic peptide
Bovine, swine
Protein A/G, anti-swine
≥23 PP
 
a For ELISAs that allow for a “grey zone” (NCPanaftosa-screening, CHEKIT-FMD-3ABC) the lower cut-off was used as threshold of positivity.
b PP: percent positivity, compared to positive control.
c PI: percent inhibition, compared to negative control.
 
参考文献:
[1]NSP-ELISA鉴别FMDV感染与免疫.中国兽医科技.2003,33(8):3-6
[2]口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因的克隆表达及3B-ELISA鉴别诊断方法的初步建立.中国兽医学报.2005,25(5):490-493
[3]口蹄疫病毒3AB试剂盒的检测及比较.上海农业学报.2006,22(2):20-23
[4]Differentiation of foot-and-mouth disease virus-infected from vaccinated pigs by enzyme-linked immunosorbent assay using nonstructural protein 3AB as the antigen and application to an eradication program. J Clin Microbiol.2002,40(8):2843-8.
[5]The non-structural polyprotein 3ABC of foot-and-mouth disease virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle. Arch Virol.1997,142(10):2021-33.
[6]Novel purification method for recombinant 3AB1 nonstructural protein of foot-and-mouth disease virus for use in differentiation between infected and vaccinated animals. J Vet Diagn Invest.2005,17(3):248-51.
[7]Comparative evaluation of six ELISAs for the detection of antibodies to the non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus. Vaccine(2006).article in press.

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