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金纳米粒子在分析检测领域应用研究简介

供稿人:乐影  供稿时间:2008-7-7   关键字:金纳米粒子  分析检测  比色法  点印迹法  试纸条法  
金纳米粒子是最早出现,研究最多的纳米材料之一。目前,金纳米粒子的合成方法已经非常成熟,而其应用研究成为近几年的热点,它在生物标记、传感器构建及生物芯片检测等领域都有重要应用。常用金纳米例子尺寸约几纳米到二十纳米左右,制备简便而且可控,长期分散性、稳定性好,具有良好的生物相融性。金纳米粒子还具有一些独特的光学性质,是其在分析检测领域得以广泛应用的基础[1-6]。
 
以下介绍几种金纳米粒子在分析检测研究方面较为经典的应用。这些应用都跟金纳米粒子的颜色及颜色转变性质有关。分散状态的金纳米粒子(例如分散在水溶液中),间距大于平均粒径时呈红色;而当金纳米粒子发生聚集,粒子间距小于平均粒径时,颜色由红向蓝转变,间距越小越趋近于蓝色。这是由于金纳米粒子表面等离子体共振(surface plasmon resonance)现象引起的,即金纳米粒子间距变小时,等离子体共振吸收红移,颜色由红向蓝色转变。基于其独特的颜色和颜色转变性质,金纳米粒子被广泛用于生物标记、分析检测。比色法(colorimetry)、点印迹法(dot-blot assay)和“试纸条”法(dipstick test)是金纳米粒子应用于分析检测以来,逐渐发展的比较典型的三种检测方法。为了实现对实际样品灵敏、简便、快速的检测,研究者们从最初最简单的溶液相比色法检测,经过不断改进和创新,使检测方法更加灵敏而便于实际操作使用。
 
一.比色法(Colorimetry)
比色法是最早应用金纳米粒子进行分析检测的一种方法,主要在溶液相中进行。其一般原理是,将金纳米粒子表面进行特定功能化,修饰上探针分子,使金纳米粒子在存在目标检测物时,能够发生聚集,例如,目标检测物可以结合两个或以上的修饰有探针分子的金纳米粒子,促使原先分散的金纳米粒子发生聚集,溶液颜色由此发生改变并与目标检测物的量有关,根据溶液颜色变化进行定量分析。反之,也可以利用预先聚集的金纳米粒子,被目标分析物作用后发生定量去聚集,溶液颜色发生变化进行检测。
 
美国西北大学的Mirkin和Letsinger等人在1997年277卷《科学》杂志上发表了题为“基于金纳米粒子间距相关性光学性质的选择比色法检测多聚核苷酸”(Selective Colorimetric Detection of Polynucleotides Based on the Distance-Dependent Optical Properties of Gold Nanoparticles)的文章[1]。他们利用金纳米粒子聚集,溶液颜色改变对DNA进行了简易、快速的定量检测。这种比色法对目标DNA具有良好的选择性,而且无需特殊仪器,甚至用肉眼即可进行定性和粗略定量分析。
 

他们首先合成粒径约13±2 纳米的金纳米粒子,并在纳米粒子表面分别修饰了两种探针DNA分子(DNA1、DNA2)。这两种探针DNA分子是和目标DNA分子(DNA3)的两部分分别完全互补的。“DNA1、DNA2-金纳米粒子”可以稳定分散在水溶液中,呈红色;当DNA3被加入到溶液中后,可以同时与一个“DNA1-金纳米粒子”和一个“DNA2-金纳米粒子”结合,使原先分散的金纳米粒子发生一定程度的聚集。目标DNA的含量越高,则纳米粒子的聚集程度越大,溶液颜色转变越明显,根据颜色变化程度可以推得目标DNA的量。这种比色法选择性好,因此可以区分完全互补的目标DNA分子(DNA3)和一个碱基错配的DNA分子(DNA4)。DNA分子发生一个碱基的变异,即单核苷多态性是最普遍和重要的一种基因变异,和个体的体质、疾病易感性、药物敏感等有着密切关系,因此检测区分出单碱基错配也是非常重要的。DNA4加入分散有“DNA1、DNA2-金纳米粒子”溶液时,由于不是与DNA1、2完全互补,引起金纳米粒子的聚集程度要小于DNA3,则溶液颜色变化小于后者,由此可以区分DNA3和DNA4。原理示意,如图1所示。

图1:金纳米粒子溶液比色法测DNA原理示意图

 
以上基于溶液中金纳米粒子聚集进行目标分子检测的方法简易快速,但是局限于可以直接结合探针分子引起金纳米粒子聚集的检测物。如果要检测不能结合多个探针分子,引起金纳米粒子聚集的待检测物,则不能使用上述方法。
 
美国Illinois大学的Yi Lu等人设计一种可以用比色法检测腺苷(Adenosine)的途径[2]。腺苷是小分子,不能像DNA分子那样连接两个金纳米粒子。他们首先合成了可以特异性结合腺苷后被激活的DNA酶(DNAzyme,也是DNA分子)。当DNA酶结合腺苷时被激活,在DNA酶互补链的特定部位就可以被镁离子切断,使DNA酶和互补链分开。检测时,表面功能化的金纳米粒子可以与DNA酶和互补链连接在一起,形成聚集状态呈蓝色。但是,溶液中有腺苷时,DNA酶结合腺苷被激活,互补链被镁离子切断,DNA酶和互补链分开,金纳米粒子无法通过DNA酶和互补链连接在一起,分散在溶液中呈红色。腺苷的量决定着互补链被切断的多少,从而间接影响着金纳米粒子的聚集,以此达到通过溶液颜色来定量检测腺苷。
 
上面两种方法有一个共同的不足,都需要对金纳米粒子进行特殊功能化修饰,这增加了操作方法到的繁琐和难度。中国科学院长春应用化学研究所的汪尔康院士研究组,发展了一种无需修饰金纳米粒子的比色法,定量检测了蛋白质凝血酶[3]。该方法巧妙利用了金纳米粒子本身的聚集性质。金纳米粒子在水溶液中的分散性质与盐浓度有密切关系,盐浓度越高金纳米粒子越容易聚集。但是,单链DNA可以有效结合缠绕在金纳米粒子表面,增加了金纳米粒子分散稳定性,使纳米粒子在高盐浓度下也不会聚集。他们选择一种能特异性结合凝血酶的单链DNA(称为适配子,aptamer)。检测时,溶液中没有凝血酶时,单链DNA结合在金纳米粒子表面,使其在高盐浓度下也稳定分散在水溶液中呈红色;而溶液中有凝血酶时,单链DNA优先结合凝血酶,金纳米粒子自身不能在高盐浓度下稳定分散,溶液颜色趋于蓝色。凝血酶越多,则与金纳米粒子结合的单链DNA越少,在高盐浓度下金纳米粒子越容易聚集,根据颜色变化可以得到凝血酶的定量分析结果。
 
由于金纳米粒子在溶液中的颜色变化在红到蓝色之间,用肉眼难以准确定量。所以一般可以取1~3微升的金纳米粒子检测溶液,滴在C18薄层层析板(thin-layer chromatography)上。溶液蒸发后,原来未聚集的金纳米粒子的点为粉红色,聚集的金纳米粒子的点颜色转变更加明显,这可能由于在溶液中已经聚集的金纳米粒子在层析板上会进一步聚集,使颜色转变增加。
 
前面三个工作均以比色法进行检测,根据待检测物的特点,经过精心设计,可以应用于很多不同性质分析物的检测。但是这类方法仍存在不足,即需要精确配制溶液,对操作人员要求高;另外,不借助仪器用肉眼还是难以准确定量分析。如果颜色比较是在白色基底上进行,或者可以放大颜色对比,则有利于提高检测灵敏度。点印迹法即在白色基底上进行检测,并由银沉积扩增检测信号,是更加灵敏的检测方法。
 
二.点印迹法(Dot-Blot assay)
这种分析方法主要利用金纳米粒子本身具有颜色,对白色基底(如硝化纤维膜)上点样点处的待检测物,进行染色定量分析。金纳米粒子表面需要修饰上,特定可以和待检测物结合的探针分子;待检测物通过吸附或其他方法附着固定在基底上,形成含有不同量待检测物的点样点。基底上样品点之外部分进行了封闭,尽量减少金纳米粒子在表面的非特异性吸附造成的干扰。将点样点在分散有修饰探针分子的金纳米粒子溶液中进行孵育,充分结合后取出,此时依据点样点上所固定的待检测物的量多少,结合了相应数量的金纳米粒子。再将点样点浸泡在银离子溶液中,银离子会在金纳米粒子表面沉积,使原有的颜色进一步加深,而结合的金纳米粒子越多,银沉积的也越多,有利于进一步增加信号灵敏度。
 
台湾国立台北大学Chun-Yen Huang等人利用点印迹法进行了免疫检测[4]。他们合成了表面修饰有可以结合待检测分子的抗体(即探针分子)的金纳米粒子。检测时,将一定体积含有待检测分子的溶液滴在白色硝化纤维膜上,待检测分子可以吸附固定于膜表面;然后将膜在含有修饰了探针分子的金纳米粒子溶液中孵育,通过待检测分子-抗体的结合将金纳米粒子连接固定到膜表面。膜上金纳米粒子颜色越深,则该点样点处待检测分子越多,由此可以实现定量检测。为了进一步增加检测灵敏度,他们在金纳米粒子表面沉积银,放大检测信号。实验比较表明,通过银沉积放大,可以将检测灵敏度提高1000倍(从100 amol 到100 zmol)。这个方法可以扩展到很多免疫检测上,只要在金纳米粒子表面修饰合适的抗体作为探针分子。
 
长春应用化学研究所汪尔康小组通过点印记阵列的方法,实现了对蛋白质凝血酶的简便、快速和灵敏的检测[5]。该工作的一个特点是使用点印记法,另一个特点为采用适配子作为蛋白质检测探针。适配子一般是指具有特定序列,能特异性结合生物分子,如蛋白质或者小分子的单链DNA。蛋白质与对应适配子的结合,具有可以比拟“抗原-抗体结合”的特异性和结合常数,而适配子的合成、纯化非常简单,因此近年来适配子被普遍应用于蛋白质的检测。Wang等首先合成了粒径约13nm的金纳米粒子,再将其表面修饰上凝血酶的适配子。检测时,将含有待检测物凝血酶的溶液滴在硝化纤维膜(nitrocellulose membrane)上。凝血酶通过静电、疏水作用而固定在硝化纤维膜表面,再将膜上空余部分用10%牛血清白蛋白(BSA)封闭,减少其后金纳米粒子的非特异性吸附。然后,将硝化纤维膜浸泡在含有适配子修饰的金纳米粒子溶液中孵育。此时金纳米粒子便会和硝化纤维膜表面的凝血酶结合,凝血酶越多,结合的金纳米粒子越多,则该处颜色越深。经过银沉积到金纳米粒子上,可以进一步增加检测灵敏度。他们还检测了模拟实际样品的凝血酶含量,发现含有低于8%的血浆不会明显降低检测效果,但是10%以上的血浆会干扰检测。
 
以上点印迹法的检测灵敏度有了很大提高,但是仍需要训练有素的专业人员进行检测操作。为了进一步提高方法的实用性,有必要简化操作过程,降低复杂程度,以便日常家庭中的使用。
 
三.“试纸条”法(dipstick test)

美国Illinois大学的Yi Lu研究组,研制出一种以金纳米粒子为信号指示剂,使用像“试纸条”一样方便的分析检测方法[6]。该方法的主要原理是,分散的金纳米粒子可以随溶液的毛细作用在试纸上迁移,而聚集的金纳米粒子由于质量、体积太大几乎不能迁移(如图2所示)。他们合成了适配子功能化的金纳米粒子聚集体。适配子前面简单介绍过,是一种能特异性结合目标分子的单链DNA片段。在这里适配子修饰的金纳米粒子是通过与适配子互补的DNA链进行“耦联”聚集在一起,被滴加在试纸条的底端。将试纸条底端浸泡于含有待检测物分子的溶液中约20秒,此时试纸条底端充分吸收了溶液,溶液通过毛细作用沿试纸条迁移。溶液中待检测物分子遇到金纳米粒子聚集体,会与其表面修饰的适配子结合,而使互补的DNA链脱离,导致金纳米粒子聚集体分散。此时,分散开的金纳米粒子便可以随溶液向试纸条另一端迁移。溶液中待检测物分子越多,金纳米粒子聚集体解离越多,能够迁移到试纸条另一端的金纳米粒子也就越多。如果溶液中没有待检测物分子,金纳米粒子聚集体不会解离,也就不能随着溶液迁移到试纸条另一端。

图2 试纸条法检测原理示意图

 
因此,根据迁移到试纸条另一端金纳米粒子的量,可以定量检测出待检测物分子的浓度。只要预先生产出“试纸条”,使用时几乎不用任何复杂操作,仅仅浸泡在溶液中几十秒取出,在几分钟内即可得到检测结果。而这种方法整合了“结合-分离-检测”步骤(binding,separation and detection),在白色试纸条上很容易辨别出信号,完全没有背景干扰,灵敏度也较溶液相中比色法有了很大提高。这种利用金纳米粒子作为信号指示剂的“试纸条”法可以扩展到很多物质的检测,只要构建适当体系,使金纳米粒子在检测前后发生聚集和分散。
 
综上所述,金纳米粒子具有良好生物相容性、独特光学性质,基于其特殊性质构建的一系列分析检测方法可以广泛应用于生物分子检测、免疫分析等领域。随着方法的不断改进和创新,这些分析检测方法越来越趋向于满足灵敏、快速、简便的实际应用需求。
 
参考文献:
[1] Elghanian R., Storhoff J.J., Mucic R.C., Letsinger R.L., Mirkin C.A., Science 1997 277: 1078-1080.
[2] Liu J.W., Lu Y.,Anal.Chem.2004 76:1627-1632.
[3] Wei H., Li B.L., Li J., Wang E.K.,  Chem. Commun., 2007:3735
[4] Hou S.Y., Chen H.K., Cheng H.C., Huang C.Y., Anal.Chem.2007 79:980-985.
[5] Wang Y.L., Li D., Liu Z.J., Dong S.J., Wang E.K., Chem.Comm. 2007:2520-2522
[6] Liu J.W., Mazumdar D., Lu Y., Angew.Chem.Int.Ed. 2006 45:7955-7959.
 
作者简介
乐影,上海情报服务平台兼职情报分析员。

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