第一情报 ---生物与医药

乳腺生物反应器的产业化进展

供稿人:赵晓勤  供稿时间:2013-1-14   关键字:乳腺生物反应器  产业化  知识产权  
转基因动物是遗传学研究史上具有里程碑意义的工作,它开创了生物医药产业的新途径。但新的问题随之出现,即导入的药物蛋白基因所表达的部位与原来的期望往往不一致。因此,让药物蛋白基因表达控制在某一特定部位,而不是随机地在身体任意部位表达就成了新的研究课题。就基因药物而言,最理想的表达场所是乳腺。因为乳腺是一个外分泌器官,乳汁不进入体内循环,不会影响到转基因动物本身的生理代谢反应。从转基因动物的乳汁中获取目的基因产物,不但产量高、易提纯,而且表达的蛋白经过充分的修饰加工,具有稳定的生物活性。用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产乳量高的动物就相当于一座大型药物工厂。细菌基因工程需要很大的发酵车间,细胞基因工程也需要很多昂贵的设备来培养细胞。而若用转基因动物,就只需要养活牛、羊等动物即可。在这种思路的引领下,“乳腺生物反应器”应运而生。
一、乳腺生物反应器的原理
乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)的基本原理是应用重组DNA技术和转基因技术先将目的基因置于乳腺特异性调控序列之下,再将表达载体转移到处于原核阶段(或1~2细胞的受精卵)动物胚胎中,经过胚胎移植得到转基因乳腺表达个体,在其乳汁中提取具有生物活性的重组蛋白。目的基因在乳腺中特异性表达需要乳蛋白的启动子和调控区,即启动内源性乳蛋白的基因表达调控元件。研究结果表明,表达调控元件可以跨越种属界限交叉使用,但绵羊、山羊和牛乳腺生物反应器适宜采用自身的乳蛋白调控元件指导目的基因特异高效表达。
二、乳腺生物反应器的产业化进展

(一)国外产业化进展

20世纪80年代末90年代初,相继出现了以乳腺生物反应器技术为核心的三大技术公司,即美国的 GTC(Genzyme Transgenics)、英国的 PPL(PPL-Therapeutics)和荷兰的 PBV(Pharming BV)。目前全世界从事该项商业开发的公司已有 30 多家,表达水平达到可以进行商业化的药物蛋白达 40 余种,其中已在进行临床观察的有 10 余种,如 AAT、hPC、tPA、F-Ⅸ、F-Ⅷ、乳铁蛋白、人血清白蛋白、抗凝血酶Ⅲ、胶原、血纤蛋白原等,有些已进入了Ⅲ期临床阶段(详见表1)。2006年8月,全球第一个通过乳腺生物反应器生产的药物 ATryn 批准上市。

1:乳腺生物反应器表达人重组蛋白产品的研发状况
 

数据来源:引自Bosze等(2008)。

GTC 公司以生产重组药物蛋白和单克隆抗体为主导产品。目前已经在不同转基因动物的乳腺中表达了 65 种蛋白,其中 45 种(14 种在转基因山羊中表达)的表达水平达到了1g/L 以上,而在山羊的乳腺中表达的AT-Ⅲ已进入Ⅲ期临床阶段。GTC 率先以乳腺反应器生产单克隆抗体,已在山羊乳汁中生产了8 种以上单克隆抗体。PPL公司于1994年开始构建乳腺生物反应器,1997 年克隆了绵羊“多利”,1999 年进行体细胞基因打靶研究,并于次年培育出体细胞基因打靶绵羊。PPL 重点开发AAT、人胆盐刺激脂酶和纤维蛋白原 3 种药物蛋白,其中在绵羊乳汁中表达的AAT达到了40g/ L,已进入Ⅱ期临床。PBV 公司致力于建立转基因兔和牛的技术平台,重点研究和开发C1-抑制因子、纤维蛋白原、胶原蛋白和乳铁蛋白等。其转基因兔乳腺反应器生产的C1-抑制因子已进入Ⅱ期临床,转基因牛乳汁中表达的人乳铁蛋白即将进入Ⅱ期临床。除三大公司外,还有大小不等的多家公司,如日本的Somitomo Metals公司、加拿大的Nexia生物技术公司等。Abgenix和Medarex 两家公司用小鼠乳腺反应器来生产治疗性单克隆抗体,已有产品进入临床阶段。

(二)国内产业化进展
 
中国对乳腺生物反应器的研究起步较早,1983年,施履吉院士首次提出利用转基因动物乳腺生产重组蛋白的构想,并在国内率先获得表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔,为中国乳腺生物反应器研究奠定基础。国家“863”计划曾将乳腺生物反应器列为重大项目进行资助,1996年,上海医学遗传研究所与复旦大学遗传所合作研究,成功地在转基因山羊乳汁中表达了人凝血因子Ⅸ,标志着中国乳腺生物反应器构建的开始。从此,中国逐步成功制备兔、猪、绵羊、山羊和牛乳腺生物反应器,并表达了20多种重组蛋白,但在表达水平上与国外相比有很大差距。阎喜军等(1999)用乳头管导入法和乳腺直接导入法制备表达人促红细胞生成素(hEPO)的大鼠乳腺生物反应器,两种方法下的表达量分别仅为0.64和0.006 ng/mL。在制备乳腺转基因动物技术上,中国主要使用经典显微注射技术和核移植技术并取得一定成果。李宁等(2008)首次在国际上利用核移植技术制备出表达人乳铁蛋白(hLF)的牛乳腺生物反应器,表达量为3.4 mg/mL,为世界重组人乳铁蛋白在乳汁中最好表达水平;邹贤刚等(2008)利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器生产人的抗凝血酶Ⅲ(TyrnⅢ)蛋白,表达量达到3 mg/mL。黄培堂等(2009)采取连续3步“Gap-repair”构建小鼠乳清酸蛋白基因-乳铁蛋白基因(WAP-hLF)杂合基因座的策略,实现小鼠乳腺中乳铁蛋白表达量高达29.8 mg/mL,并且具有天然活性。最近,Zhang等(2010)运用核移植技术建立表达人葡萄糖苷酶的萨能山羊乳腺生物反应器,从核移植供体细胞和移植胚胎优化核移植程序。Zhao等(2009)首次利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠,从而在世界上第一次证明了iPS细胞系的发育潜能,对尚未建立胚胎干细胞系的大动物兔、猪、羊和牛来讲,这项研究为通过iPS细胞系的基因打靶制备乳腺转基因动物奠定了基础。虽然中国在乳腺反应器的研究中已取得一些进展,但总体上,中国的研究与国外的研究相比仍存在一定差距,主要体现在:①研究成果少,而且没有国际专利;②重组蛋白表达效率相对低,且表达的随机性相对较强,难以进行工业化生产。
 
目前,中国已有企业对动物乳腺生物反应器进行研发,开始了产业化之路。由于乳腺生物反应器的产业化前期投入大、上市的产品少和专利瓶颈、企业对风险大的药用蛋白顾虑多等因素,国内能够完全跟进世界产业化步伐的企业寥寥无几。成国祥主持的上海转基因研究中心和上海杰隆生物工程股份有限公司,是目前国内最大的乳腺生物反应器产业化研发基地,重点研发山羊乳腺生物反应器,主导产品是乳铁蛋白(hLF)、溶菌酶(hLZ),已在国内申请专利10多项。
三、乳腺生物反应器知识产权状况

(一)国外

根据现有文献资料,全球以乳腺生物反应器技术为核心的三大公司的知识产权情况大致如下:
 
1. 美国GTC(GTC Therapeutics)公司
该公司以生产药用重组蛋白和单克隆抗体为重点,具有最成熟的山羊乳腺生物反应器构建技术平台,拥有通过核移植技术制备山羊乳腺生物反应器核心专利。此外,GTC公司率先用乳腺生物反应器制备单克隆抗体,获得美国单抗生产专利保护。
 
2. 荷兰PBV(Pharming B V)公司
PBV公司致力于研究构建转基因兔和牛的技术平台,拥有36项专利,重点研发C1-抑制因子(C1-INH)、纤维蛋白原(hFIB)、胶原蛋白(hCOL)等,其专利多涉及牛乳腺生物反应器的商业开发。PBV公司在兔乳腺中表达的药用蛋白C1-INH即将上市,该蛋白对治疗遗传性的血管性水肿有特效。此外,PBV公司与Infugn公司合作,运用核移植技术成功的在牛乳腺中高效表达纤维蛋白原。
 
3. 英国PPL(PPLTherapeutics)公司
PPL公司曾致力于构建绵羊乳腺生物反应器,并与因克隆出绵羊“多利(Poly)”而闻名世界的罗斯林研究所合作,拥有专利12项,重点开发抗胰蛋白酶(hAAT)、纤维蛋白原(hFIB)、凝血因子Ⅶ和Ⅸ等。
 
 
从表2可以看出,目前国内乳腺生物反应器的构建主要集中在北京、广东、上海、山东、安徽等地。在这些地区中,中国人民解放军第一军医大学、北京基因达科技有限公司 、青岛森淼生物技术研究所和安徽农业大学等机构拥有为数较多的该类专利,将会相互形成一定的协作或竞争关系。
 
表2: 国内乳腺生物反应器知识产权状况一览表
 
序号
申请号
申请人/权利人
地区
1
一种乳腺生物反应器的建立方法
CN200610036514.8
南方医科大学
广东
2
一种建立动物乳腺生物反应器的新方法
CN00114224.0
中国人民解放军第一军医大学
广东
3
一种动物乳腺局部生物反应器建立的方法
CN01107529.5
黄伟民(一军大)
广东
4
用于在动物乳腺内表达SOD的重组DNA的构建方法
CN98113340.1
黄伟民 (一军大)
广东
5
动物乳腺内表达表皮生长因子的重组DNA的构建方法
CN02114901.1
黄伟民 (一军大)
广东
6
动物乳腺内表达成纤维细胞生长因子(FGF)的重组DNA的构建方法
CN02114900.3
黄伟民 (一军大)
广东
7
体内胚胎干细胞转染法建立转基因动物或乳腺生物反应器
CN00114225.9
安靓(一军大)
广东
8
重组人IFNα2b乳腺表达载体及其构建方法和应用
CN201110359665.8
广西大学
广西
9
一种利用动物乳腺生产抗人CD20单克隆抗体的方法
CN200610172293.7
北京济普霖生物技术有限公司
北京
10
乳腺特异性表达载体及其构建方法
CN200810105011.0
中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
北京
11
一种从乳腺生物反应器表达产物中分离重组人抗体的方法
CN201110240519.3
中国科学院过程工程研究所
北京
12
一种从转基因哺乳动物乳液中分离重组人抗体的方法
CN201110240626.6
中国科学院过程工程研究所
北京
13
一种生物钢基因及其编码的蛋白质
CN01134511.X
李宁;北京基因达科技有限公司
北京
14
生物钢基因和它编码的蛋白质
CN01134509.8
李宁;北京基因达科技有限公司
北京
15
生物钢基因及其编码的蛋白质
CN01134510.1
李宁;北京基因达科技有限公司
北京
16
生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——转基因克隆大型家畜的方法
CN200510066118.5
李宁
北京
17
小鼠乳腺原基移植再生功能性乳腺的方法
CN200510011626.3
李宁
北京
18
生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法
CN200510066116.6
李宁
北京
19
生产重组人溶菌酶的动物乳腺生物反应器——人溶菌酶转基因克隆大型家畜的方法
CN200510066117.0
李宁
北京
20
利用动物乳腺生物反应器生产人源化单克隆抗体的方法
CN200910083943.4
北京济普霖生物技术有限公司 
北京
21
用动物乳房生产人的生长激素
CN97116678.1
中国农业大学
北京
22
利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法
CN200610102042.1
青岛森淼生物技术研究所
山东
23
利用非人哺乳动物乳腺生物反应器生产乙型肝炎疫苗的方法
CN200410096457.3
青岛森淼生物技术研究所
山东
24
一种利用基因打靶技术制备哺乳动物乳腺生物反应器的方法
CN200510055256.3
青岛森淼生物技术研究所
山东
25
一种大片段DNA制备乳腺生物反应器新方法
CN00115793.0
上海中路生物工程有限公司
上海
26
牛催乳素基因组序列、含其基因的载体及其应用
CN01112604.3
上海滔滔转基因工程股份有限公司 (项目方)
上海
27
一种促人血小板生成素的制备方法
CN02136029.4
上海医学遗传研究所;中国人民解放军第一军医大学;上海滔滔转基因工程股份有限公司(项目方)
上海
28
一种促人血小板生成素表达载体及其构建方法
CN200810086477.0
上海医学遗传研究所等(项目方)
上海
29
通过Cre-LoxP定点打靶体细胞克隆家畜作为乳腺生物反应器的研制
CN02145433.7
上海杰隆生物工程股份有限公司
上海
30
牛iPS细胞诱导分化形成卵母细胞的方法
CN201210167044.4
安徽农业大学
安徽
31
乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法
CN201210100640.0
安徽农业大学
安徽
32
山羊乳腺上皮细胞的建系方法
CN201210113304.X
安徽农业大学
安徽
33
高表达水平的转基因动物乳腺特异性载体的构建方法
CN200610040436.9
扬州大学
江苏
34
关中奶山羊酪蛋白基因启动子表达载体
CN200410073164.3
中国人民解放军第四军医大学
陕西
35
多用型乳腺特异性表达载体及其构建方法
CN200410060585.2
张钦宪
河南
36
人gdnf基因在牛β-casein基因座的定位整合载体及其应用
CN201010158331.X
内蒙古大学  
内蒙古
 
数据来源:中国知识产权网,上海科学技术情报研究所收集整理。
主要参考文献
1.  Bosze Z, Baranyi M, Whitelaw CB. Producing recombinant human milk proteins in the milk of livestock species. Adv Exp M ed Biol. 2008, 606: 357-393
2.  Echelard Y, W Illiams JI, Destrempes MM, et a1. Production of recombinant albumin by a herd of cloned transgenic cattle. Transgenic Research. 2009, 18(3): 361-376.
3.  Houdebine LM. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 2009, 32(2): 107-121.
4. Shi G, Chen H, Wu X, et a1. A mW AP-hLF hybrid gene locus gave extremely high level expression of human lactoferrin in the milk of transgenic mice. Transgenic Research. 2009, 1 8(4): 573-582.
5.  Zhang YL, Wan YJ, Wang ZY, et a1. Production of dairy goat embryos, by nuclear transfer, transgenic for human acid B-glucosidase. Theriogenology. 2010, 73(5): 681-690.
6.  曾溢滔. 转基因动物与生物医药产业. 生物学通报. 1999, 34(4): 1-3.
7. 付玉华, 周秀梅, 钱其军. 乳腺生物反应器的研究和产业化进展. 中国畜牧兽医. 2010, 37(8): 45-51.
8.  石国庆, 朱汇, 万鹏程等. 动物生物反应器研究进展. 南京晓庄学院学报. 2011(3): 1-7.

注册成为正式用户,登陆后,获得更多阅读功能与服务!
转载本文需经本平台书面授权,并注明出处:上海情报服务平台www.istis.sh.cn
了解更多信息,请联系我们

§ 请为这篇文章打分(5分为最好)