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CAR是由胞外抗原识别区（主要为抗体的单链抗体片段（scFv）、自然配体和抗体的抗原结合片段（Fab）等）、连接子、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成，它能使淋巴细胞识别肿瘤细胞表面特异性的抗原，同时激活淋巴细胞，从而靶向杀伤肿瘤细胞。CAR可使免疫细胞以不受MHC限制的方式识别肿瘤表面抗原，增强免疫细胞的靶向性。自1989年第一代CAR的诞生，CAR结构目前已发展到共表达细胞因子转基因的第四代。第一代CAR主要为scFv、连接子、跨膜区胞内信号结构域（CD3ζ），第二代CAR在第一代CAR的基础上添加了共刺激信号结构域（4-1BB或CD28），第三代CAR在第二代CAR的基础上，同时表达两个共刺激信号结构域（4-1BB和CD28），理论上第三代CAR的持续时间要长于第二代CAR。因其良好的靶向性、杀伤性和持续性，目前CAR技术已被广泛用于T细胞，并在白血病和淋巴恶性肿瘤的临床试验中显示出良好的效果。
一、不同来源的NK细胞在CAR-NK中的作用
1. NK-92细胞系
NK-92细胞系已被证明是CAR-NK细胞最广泛使用的来源。与原型NK细胞相比，NK-92细胞缺乏多种激活剂受体，包括CD16、NKp44和NKp46以及除KIR2DL4外的大多数抑制性KIR。包括ErbB2、HER2、CD19、CD20和CD138的肿瘤抗原特别针对CAR-NK-92细胞。根据一项研究的结果，在CAR-NK-92细胞系中，ALL细胞比NK-92介导的裂解更易抗CD19。较少的不良反应是由于这种CAR转染的NK-92细胞的寿命有限。
2. 外周血和精髓血NK细胞
根据对急性髓系白血病（AML）的临床研究结果，来自UCB和PB的NK细胞也可能影响白血病。与NK-92细胞系相比，PB衍生的NK细胞产生更多的活化剂受体，包括CD16、NKp44和NKp46，并增加攻击信号强度。尽管PB-NK细胞表现出更多的异质性，但CD16的转染对其ADCC并不重要。尽管饲养细胞是NK细胞活化和扩增所必需的，但通过血液单采获得饲养细胞可能是困难和耗时的。此外，PB中NK细胞的纯化阶段将其体内寿命缩短至几周，导致治疗效果低下。另一方面，UCB是同种异体NK细胞的丰富来源。其被冷冻保存的潜力预示着很有可能成为现货产品。具有更高百分比的组成和更低的细胞毒性，使来自UCB的NK细胞远优于来自PB的NK细胞。此外，移植后，与PB相比，由于独特的NK细胞祖细胞，NK细胞在UCB中的恢复速度更快。产生IL-21或IL-15的人工抗原呈递细胞已用于研究，以确定大规模NK细胞生产是可能的。改进的UCB-NK细胞显示出CD56+CD3的优异纯度（接近95%），并提高了穿孔素和颗粒酶B的活性。
3. 由诱导的多能干细胞发展而来的NK细胞
表达CAR的NK细胞的潜在来源包括iPSC和hESC。由NK-92、PB-NK细胞和UCBN引起的一些障碍可以被iPSC NK细胞所克服。它们产生KIR、NKp44和NKp46，与NK-92细胞相反，甚至在给药前也不需要照射；除异质PB-NK细胞外，它们显示出CAR的均一性和一致性。比较了从PB和iPSC获得的NK细胞在去除卵巢癌细胞中的细胞毒性作用，并从两种NK细胞群体中获得了同样有意义和有效的结果。效应NK细胞的抗肿瘤活性可以通过CAR的表达而被进一步放大。有趣的是，与CAR-T细胞相比，CAR iPSC NK细胞的抗肿瘤效果相当，但毒性降低。原则上，CAR iPSC NK细胞有望成功消除实体瘤。
二、国外关于NK92改构的CAR-NK临床研究进展
NK-92最初来源于NK淋巴瘤患者的血液，该细胞系不表达KIRs。Nant Kwest通过装上一个CAR对NK92进行了改造，并针对胶质母细胞瘤进行试验。其中aNK细胞的安全性已经在几十个 I 期临床（针对恶黑和实体瘤）中得到验证，其安全性、活性和对生存期的延长已经证实。在第31届癌症免疫治疗协会（SITC）年会上，Nant Kwest在演讲中介绍了使用同种异体激活的自然杀伤（aNK）细胞与晚期梅克尔细胞癌（MCC）的过继性细胞治疗，并显示出良好的初步结果，目前正进行关于aNK自然杀伤细胞治疗在默克尔细胞癌II期临床研究。
St. Jude Children's Research Hospital进行的治疗急性淋巴细胞白血病的试验（Clinical Trials. Gov. NCT00995137）。在这项研究中，供体NK细胞与能够表达IL-15和41BB配体的K562细胞（K562- mb15-41BBL）共培养，在IL-15和41BB配体刺激下能够实现NK细胞的特异性扩增，扩增的NK细胞表面再修饰CD19受体，获得CAR-NK细胞后回输到患者体内，目前正进行 I 期临床。来自新加坡国立大学医院，用于儿童及成人难治性急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）使用的CAR结构与St. Jude Children's Re-search Hospital相同，只是在NK细胞扩增过程中以IL-2代替IL-15。实验数据目前已完成所有临床试验，但没有相关的临床数据报道，而且有相关报道显示此CAR-NK细胞的生产流程符合GMP的要求。
三、国内关于NK92改构的CAR-NK临床研究进展
博生吉医药科技（苏州）有限公司携手合肥市第一人民医院集团滨湖医院正在进行新一代“CAR-NK细胞技术用于治疗T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、NKT细胞淋巴瘤和NK细胞淋巴瘤的临床研究”。此次研究公开招募首期患者，共计20例进行I期临床研究。
阿思科力生物科技有限公司利用pDC-T和CAR-NK联合治疗，其中白血病治疗后1个月的检测显示微小残留病灶为阴性，表明获得了完全缓解，到6个月随访时，外周血中没有检测到有白血病细胞存在。该团队所开发成熟的细胞治疗药物包括pDC-T，CAR-NK，pDC-T和CAR-NK联合细胞药物、CAR-T细胞药物，这些细胞药物中既有针对特定恶性肿瘤的细胞药物、也有针对多种恶性肿瘤的广谱细胞药物，涵盖了血液淋巴系统、实体瘤等几十种恶性肿瘤。目前，更多的临床治疗正在开展。
四、CAR-NK应用于血液肿瘤治疗
在临床前和临床研究中，CAR工程NK细胞靶向多种抗原，包括CD19、CD20、CD33、CD138、CD319（已描述为信号淋巴细胞活化分子家族成员7，SLAMF7）、CD3、CD5和CD123，在体外和体内测试其抗肿瘤活性。此外，第三代CAR（CD19-4-1BB-CD28−ζ）-2016年转导的NK-92细胞系被纳入仍在进行的I/II期临床试验。NK92-CD19中−CD3ζ细胞增强了NK细胞的敏感性及其对B系恶性细胞的细胞毒性。随后，经CAR-NK细胞治疗后，异种白血病的扩张率急剧下降，光学体内成像证实了这一点。Chu等人使用核转染技术使PB-NK细胞发生由CD20-BBζ-mRNA引发的某些变化，从而通过与K562-mb-IL15-41BBL共培养激活CAR-NK细胞，从而增加对利妥昔单抗耐药的Burkitt淋巴瘤的细胞毒性，延长小鼠的存活时间。CD138-CAR-NK-92具有类似的影响，有助于多发性骨髓瘤（MM）小鼠模型具有更长的生存期。CD138-CAR-NK-92改善了多发性骨髓瘤（MM）小鼠模型的存活率。复发的MM患者最近使用SLAMF7定向CAR-NK细胞与治疗性CD38定向抗体daratumumab联合治疗。
有趣的是，CAR-NK9细胞靶向非肿瘤靶点EBNA3C对Epstein-Barr病毒阳性T细胞进行了卓有成效的清洗，证实了其卓越的潜力。另一方面，源自原代NK细胞和NK细胞系的CAR NK细胞仅用于9项临床试验，其中6项临床试验用于确定CAR-NK92免疫疗法的安全性。淋巴瘤和白血病（NCT02742727、NCT02892695和NCT02944162）已被选为CD19、CD7和CD33的靶点。源自PB或UCB的CD19-CAR-NK细胞已经历了三次连续的临床实验。用包含产生IL-15的iCasp9/IL-15自杀基因的CAR转染源自UCB的NK细胞，以建立存活并产生自杀基因。令人惊讶的是，2017年，这种疗法被批准用于B细胞淋巴瘤I期/II期研究。
五、CAR-NK应用于实体瘤治疗
参考文献
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